锐谈 | PNAS: 强启动子的合成设计方案

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发布时间：2023-10-16 10:09
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启动子元件的有效活性是限制人工遗传系统发展的主要影响因素。例如，基于DNA的shRNA系统由更强启动子驱动时能够表达出更高水平。目前使用的许多强启动子在不同的细胞背景下具有高度可变的转录水平，并且在许多细胞系中表达较少或不表达。这限制了功能丧失和功能获得。对于此，作者提供了一种强启动子的合成设计方案，通过合成生物学的方法来筛选人类细胞中转录因子的结合位点活性。

通过在Nimblegen微阵列上打印寡核苷酸，生成了含有10个重复序列的合成增强子库。在阵列上打印的每个序列由10个10- mer重复序列组成，以产生一个100-mer的寡核苷酸，该寡核苷酸的两端分别有限制性酶切和引物结合位点。每个100-mer实际上包含10个不同的10-mer重复序列。

从微阵列上切割出约5Mb的寡核苷酸并进行pcr扩增，然后限制性克隆到载体pSJ2中，并通过逆转录病毒载体使单个构建体整合到细胞。当在低感染多重性(MOI)下使用时，减少了会混淆启动子多重整合的发生。EGFP为最小CMV启动子的总体转录水平提供了一个标记，可以很容易地通过FACS检测。使用自灭活载体可以防止启动子受到病毒LTR的干扰，后者包含3 ' LTR的缺失，导致逆转录病毒启动子在整合到基因组中时完全失活。MCS被设计成包含多个具有兼容末端的限制性位点，用于随后同时插入多个增强子，这在后来的组合实验中变得很重要。例如，EcoRI- xhoi增强子片段可以被重新克隆到MfeI-SalI或EcoRI SalI中以进行双插入。增强子也可以作为BamHI-EcoRI片段切除，并插入到BglII-MfeI切割片段中。

为了测试使用10-mer重复序列文库筛选增强子元件的可行性，重复序列的质粒文库被包装成逆转录病毒，感染到HeLa细胞上。这将导致库中存在许多较弱的增强子。尽管最小的CMV启动子的转录水平并不明显高于未感染细胞，但含有增强子的HeLa细胞上的FACS显示，超过15%的10-mer重复文库插入物能够提高CMV启动子背景水平的转录增强。不到1%的细胞能够将GFP表达水平驱动到WT CMV增强子驱动构建体的范围内。第三轮筛选完成后，将剩余插入物进行pcr扩增并克隆为质粒文库。对质粒DNA进行测序。测序显示，许多克隆含有高度相似的序列，代表了几种主要的转录因子结合位点。回收的主要克隆类的个别代表被包装成逆转录病毒并感染到细胞中。在这些个体克隆中恢复了多种增强子强度。强度范围从非常低的增强剂到与WT CMV增强剂相当的增强剂活性。在最终池中恢复了多个相关但不同的序列，支持了筛选的可重复性。