锐谈 | Nucleic Acids Res.：Retron介导的大肠杆菌多重基因组编辑和连续进化

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发布时间：2023-10-07 10:38
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随着基因治疗、代谢工程和合成生物学的不断发展，人们对新型高效基因编辑工具的需求与日俱增。近日，浙江大学徐志南和连佳长团队在Nucleic Acids Research上发表了题为“Retron-mediated multiplex genome editing and continuous evolution in Escherichia coli”的研究，该研究通过模块化、系统化的方式对反转录子（Retron）系统进行优化，在大肠杆菌中建立了一个高效的Retron介导的基因组编辑系统REGES（Retron-mediated genome editing system, REGES），并证明其在多重基因组编辑、条形码文库建立的以及基因特异性连续体内进化的应用（图1）。

Retron是由逆转录酶（Reverse Transcriptase，RT）和非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）组成的细菌遗传元件。Retron的逆转录酶可以特异性识别msr和msd转录形成的二级结构，并在体内逆转录产生多拷贝ssDNA(multi-copy ssDNAs，msDNA），随后该msDNA作为同源重组模板被整合至基因组中（图2），这一过程被发现参与细菌的抗噬菌体防御机制。若将模板序列插入至msd中的适当位置，即可产生带有目标突变的msDNA，从而在基因组中引入特定突变，然而其编辑效率较有限。通过引入强RBS以多顺反子的形式过表达来自Lambda噬菌体的单链退火蛋白（SSAP）辅助提高同源重组效率（图2），可将其编辑效率提高至60%。

该研究首先对REGES系统进行优化，从宿主改造（内源性核酸酶敲除）、Retron生物元件优化（复制、转录和翻译调控）和编辑条件优化三个方面系统性地探索了影响REGES编辑效率的关键因素，最终实现近100%的突变效率，且除碱基突变以外还可实现~50bp的碱基插入、140bp的碱基替换和~5000bp的基因删除。随后，将优化后的REGES系统应用于多重基因组编辑，对单、双、三和四基因座基因组编辑的效率分别为~100%、85±3%、69±14%和25±14%。此外，利用REGES系统生成具有简并RBS序列的条形码变体库，以微调内源性和外源基因的表达水平，以提高乙醇耐受性和生物素生物合成。最后，利用REGES系统与T7 RNAP介导的碱基编辑和易错转录相结合，实现了基因特异性的体内连续进化。通过以上案例研究，证明了REGES是一种强大的多重基因组编辑和连续进化工具，在合成生物学和代谢工程中有着广泛的应用。与CRISPR介导的基因组编辑和ssDNA介导的重组（如MAGE）相比，该研究建立的REGES具有编辑效率高、易于操作（ssDNA的体内生成）和突变范围灵活的优点。