锐谈 | ACS Catal.：深度序列-功能表征揭示增强酶活性的多种途径

【概要描述】

分类：新闻动态
作者：
来源：
发布时间：2023-10-07 09:49
访问量：

详情

深度突变扫描（DMS）可提供全面的序列功能关系图，已成为蛋白质工程改造中确定功能热点的有效方法。来自塔夫茨大学化学与生物工程系的NikhilU. Nair教授团队在DMS引导下设计野生型苯丙氨酸解氨酶（AvPAL），构建了一系列突变体并进一步评估特定的突变如何克服催化过程中限制活性的步骤。

1、AvPAL的DMS

作者对AvPAL进行随机突变获得了Naive文库，并传代了3次。随后，作者基于先前在大肠杆菌中开发的生长偶联富集方法对AvPAL进行DMS，获得其详细序列-功能图谱（图1）。通过分析，作者发现活性位点残基，包括负责催化和底物结合的残基，通常不允许突变发生(图1d和e)。因此，与活性位点残基相关的DMS数据分析的许多结果与已发表的PALs数据在很大程度上是一致的，且适应度得分与酶的催化活性具有很高的相关性。

2、序列-功能表征识别突变热点

作者计算了适应度梯度以识别突变热点，适应度梯度是通过计算相对于Naive文库的每个位置上每个突变的适应度来确定的。确定了适应度梯度最大的12个位置 (图2a)。从结构上看，最合适的突变聚集在蛋白质链的两端(图2b)。作者进一步计算了每个残基的α-碳与停靠在同一链活性位点的Phe α-碳的距离(图2c)，发现多数有益突变距离同一链的活性中心较远而靠近邻近链的活性中心 (图2d)。

3、组合突变

基于前面的分析，作者选择了7个热点位置(102,218,222,268,306,360和453)进行进一步研究(图3e)。这些残基分类为包含两个区域: (i)位于活性位点(268,306,360和453)周围的环内的残基(图3f )和(ii)聚集在活性位点表面的 α-螺旋内的残基(102,218和222)(图3g)。

为了识别有益突变体，作者利用7个热点分别构建了包含一个（7C1 7选1），三个（7C3 7选3），七个（7C7 7选7）位点突变的组合突变库，然后计算每个残基的适应度。7C1文库中所有位点都有有益突变（图 4a），而7C3 和7C7 文库中较少的突变是正向的（图 4b 和 c）。这表明，尽管许多单点突变有利于提高适应度，但大多数突变并不会起到协同作用。