DAHP合酶是芳香族化合物生物合成莽草酸途径中的第一个关键酶，酿酒酵母中存在两个DAHP合酶：Aro3和Aro4，分别受到L-苯丙氨酸 (L-Phe) 和 L-酪氨酸 (L-Tyr) 的反馈抑制，从而限制了莽草酸途径的碳通量。目前已经报道了Aro4^K229L的突变能够有效解除其反馈抑制，并广泛应用于酵母生产莽草酸途径衍生物；然而，类似的Aro3突变体Aro3^K222L对莽草酸途径碳通量的促进效果在目前报道中有差异，这种差异表明 Aro3 和 Aro4 对各自抑制剂的反应不同，并且 Aro3^K222L 可能无法完全缓解酿酒酵母中 L-Phe 的反馈抑制。

近日，天津大学罗云孜课题组发现Aro3^D154N突变体能够有效缓解苯丙氨酸的反馈抑制，过表达Aro3^D154N突变体可明显提高酵母中莽草酸途径的碳通量。他们通过结构生物学、分子动力学模拟以及生化实验推测Aro3^D154N突变体减弱了与抑制剂L-Phe的结合，从而缓解了这一反馈抑制。这一解除反馈抑制突变策略可推广至其他非模式酵母的DAHP合酶，如解脂耶氏酵母、毕赤酵母、马克思克鲁维酵母和汉逊酵母的DAHP合酶的对应位点的D到N的突变也能有效缓解其反馈抑制。文章发表在Communications Chemistry，标题为“Mechanistic investigation of a D to N mutation in DAHP synthase that dictates carbon flux into the shikimate pathway in yeast”.

主要研究内容包括：

1.酿酒酵母中过表达 Aro3^D154N 解除对 Aro3 的反馈抑制

为了在不受Aro4干扰的情况下评估Aro3突变体，作者首先在酿酒酵母菌株敲除Aro4，并过表达不同的Aro3蛋白（野生型、Aro3^K222L和Aro3^D154N），只有过表达Aro3^D154N突变体时，酿酒酵母的芳香族醇产量得到明显提高。点板试验和体外酶活试验进一步证实了只有Aro3^D154N突变体能够解除 L-Phe的反馈抑制。

2.解除变构抑制的分子基础

为了阐释这一机制，作者解析了Aro3的晶体结构，利用分子对接获得了苯丙氨酸的复合物模型，进一步利用分子动力学模拟分析推测：虽然第154位的天冬氨酸并不在抑制剂苯丙氨酸的结合口袋，但是D154N的突变体减弱了与苯丙氨酸亲和力，作者通过等温滴定量热法（ITC）试验验证了这一猜想。

3.其他Iα型DAHPS酶的D-N突变

由于酵母中的DAHP合酶具有高度同源性，作者将这一策略应用到了多株非模式酵母的DAHP合酶中，包括来自解脂耶氏酵母的 Q6CCS4 和 Q6CDZ3、来自巴斯德毕赤酵母的 C4QXT0 和 C4R611、来自马克斯克鲁维酵母菌株的 W0T5I6 和 W0TBD2、来自汉逊酵母的W1QFS3和W1QII3。测试了这些酶的D到N突变形式，尽管抑制剂和酶的来源不同，但D到N单一氨基酸残基的替代在解除酶抑制剂对生长的抑制方面显示出很强的有效性。

4.Aro3^D154N高表达菌株的代谢组学研究

接下来，作者通过代谢组学发现，过表达D154N突变体的酿酒酵母丙酮酸途径的代谢通量降低，作者推测过表达DAHP合酶可能是将丙酮酸途径的代谢通量转移至了莽草酸途径。

5. Aro3^D154N在酪醇和红景天苷高产工程菌中的过表达效应

最后作者将D154N突变体应用与酪醇和红景天苷的微生物生产，酪醇和红景天苷产量分别提高了29.1% 和 43.6%，红景天苷的产量达到2.4g/L，这也是摇瓶发酵中报道的最高水平，充分展示了这种反馈解锁策略在工业宿主中的潜力。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s42004-023-00946-x

作者：多多